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项目文章 | 透明质酸偶联甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶用于靶向药物递送

        2024年7月1号，捷方凯瑞战略合作伙伴卓强生科杨燕芳老师与扬州大学化学化工学院朱沛志教授团队在国际期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（Q1，中科院1区一级，IF: 7.7）发表题为“Hyaluronic acid-conjugated methotrexate and 5-fluorouracil for targeted drug delivery”的研究论文。

    本研究开发一种新型透明质酸偶联的甲氨蝶呤和 5-氟尿嘧啶纳米药物系统，旨在解决甲氨蝶呤和 5-氟尿嘧啶的高毒性和副作用在临床上的局限性。研究结果显示团队设计和合成的新型纳米系统可以有效地靶向癌细胞，并对CD44受体具有较高的靶向和抗肿瘤活性。同时通过构建患者来源的结直肠癌、肝癌和乳腺癌类器官，验证其抗癌作用。结果表明，本研究开发的纳米药物系统具有作为癌症靶向治疗的药物巨大潜力。

研究思路图

研究结果

1. 合成了MTX、5FUAC、HA、HA-Cys、HA-SS-5FUAC和HA-MTX 5FU，并用HNMR、FT-IR、UV-Vis、DLS、TEM和AFM等方法进行了表征

        HA、MTX、HA-Cys、5FUAC、HA-SS-5FUAC和HA-MTX 5FU的化学结构经核磁共振氢谱确证。

        DLS数据测量了颗粒尺寸，用透射电子显微镜对HA-SS的形貌进行了表征

2. 药物体外释放特征

        HA-SS-5FUAC和HA-MTX-5FU的释药速率和释放量取决于介质和谷胱甘肽的pH。肿瘤细胞内的微环境表现出弱酸性，pH=5.0，因为它能在酸性条件下提供质子，从而促进HA的降解和释放MTX。结果表明，HA-MTX-5FU在pH 5.0时的释放速度远快于在pH 7.4时的释放速度。

3. 体外药物摄取

    药物被细胞吸收。DAPI染色后核膜呈蓝色荧光，荧光倒置显微镜显示，具有绿色荧光的纳米药物与具有蓝色荧光的核膜部分重叠，表明纳米药物具有一定的核吸收。这一现象证实了5-FU和MTX在细胞内的作用机制是一致的。

4. 5FU、HA-SS-5FUAC和HA-MTX-5FU的溶血作用

    为确保HA-MTX-5FU纳米粒静脉注射的生物安全性，进行了溶血试验。甲氨蝶呤（MTX）和5-氟尿嘧啶（5FU）的溶血率相似。随着药物浓度的降低，在所有测试浓度中，溶血率都有显著的下降。在浓度为5μg/ml时，5FU、HA-SS-5FUAc和HA-MTX-5FU的溶血率均低于7%，提示其溶血毒性较低，静脉注射安全性较高。与甲氨蝶呤相比。HA-SS-5FUAC和HA-MTX-5FU的溶血率低于MTX和5FU，这可能是由于透明质酸（HA）作为药物载体的保护作用所致。HA-SS-5FUAc和HA-MTX-5FU在低浓度（5μg/ml）下的溶血率相似，均低于5%。这些发现提示HA-MTX-5FU在体外和体内研究中都有潜在的应用前景。

5. 体外细胞毒性特性

    比较MTX、5FUAC、HA-SS-5FUAC和HA-MTX 5FU对HCT116、NCM460、HepG2、LO2、MCF-7和MCF 10A细胞的抑制作用。用CCK-8检测细胞活性。5FUAC、MTX和HA-MTX-5FU对受试细胞系的增殖具有浓度依赖性的抑制作用。值得注意的是，这些药物对HCT116、HepG2和MCF-7细胞的生长显示出强烈的抑制活性。CCK-8检测结果表明，与5FUAC和HA SS-5FUAC相比，HA-MTX-5FU对癌细胞增殖的抑制作用略有增强，提示当HA-MTX-5FU与HA-MTX-5FU联用时，两种治疗药物之间具有潜在的协同作用。正常细胞的存活率约为45%，而肿瘤细胞的存活率约为25%。两者之间的差异几乎是两倍，这表明HA-MTX-5FU纳米药物由于其CD44靶向能力而优先杀死肿瘤细胞。因此，结果表明，HA-MTX-5FU对正常细胞的毒性低于对癌细胞的毒性，这是由于癌细胞表面可与HA结合的CD44受体的过度表达，使其与正常细胞相比，癌细胞更容易吸收HA-MTX-5FU。

6. 体外活体染色

    用1μ摩尔/毫升的浓度与HCT116、NCM460、HepG2、LO2、MCF-7和MCF10A细胞孵育48h后，活死染色显示HA-MTX-5FU具有比5FUAC和HA-SS-5FUAC更好的细胞杀伤能力，这是由于HA与CD44的亲和力和MTX的叶酸受体亲和力。通过给药后的实验比较发现，癌细胞的死亡细胞数明显高于正常细胞。这一结果表明该药物更有可能杀死癌细胞，进一步表明由于其靶向性，这种纳米药物更容易被癌细胞吸收。

7. 体外细胞凋亡

        1μ/mLHA-MTX-5FU作用于HCT116、NCM460、HEPG2、LO2、MCF-7和MCF10A细胞48h后，流式细胞仪检测细胞的凋亡率（Q2+Q3）明显高于正常细胞（Q2+Q3），表明癌细胞更容易被药物吸收和杀伤。HA-MTX-5FU作为抗肿瘤药物在诱导细胞凋亡方面更有效。

8. 类器官纳米药物测试

    患者来源的类器官经浓度分别为0mg/mL、0.054 mg/mL、0.107 mg/mL、0.214 mg/mL、0.428 mg/mL、0.855 mg/mL的HA-MTX-5FU处理后，对照组呈现相对致密的球形，数量较多，细胞活性较好。低浓度0.054 mg/ml组对类器官无明显影响，0.107 mg/ml药物组类器官体积和数量减少。随着药物浓度的升高，对类器官的影响越来越大，在0.428 mg/ml时，类器官数量和体积的减少有明显差异，而在0.855 mg/ml药物组，类器官几乎没有活性。本文这种新型HA-MTX-5FU纳米药物具有抑制和杀死癌细胞的作用。
    验结果证明类器官在药物筛选和肿瘤精准治疗方面具有明显优势。

本研究由捷方凯瑞提供结直肠癌、肝癌和乳腺癌类器官类器官培养技术。