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文献分享|人羊膜间充质干细胞-胰岛类器官增强小鼠糖尿病模型中胰岛植入效率
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引言
尽管胰岛移植已被证明1型糖尿病（T1DM）标准疗法的巨大潜力，但这种方法仍然受到移植后早期缺血、缺氧和血管重建不良以及炎症和终身宿主免疫排斥的限制。
研究结果
1. hAMSC和GFP-LuchAMSC的表征原代培养和传代hAMSC形成单层贴壁细胞，呈梭形、成纤维细胞样形态，hAMSC对胚胎干细胞标志物和MSCs标志物呈阳性，通过荧光显微镜下GFP表达情况评估慢病毒转染效率，经嘌呤霉素筛选后，95%以上的感染hAMSCs呈GFP阳性。体外，hAMSCs和GFP-Luc-hAMSCs在成骨和成脂分化条件下均能诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。这些结果表明，GFP和荧光素酶的转染对hAMSCs的特性没有影响。
2.hAMSC-胰岛类器官的体外形成和评估将GFP-Luc-hAMSC与完整小鼠胰岛以250:1的比例混合，然后接种在3D琼脂糖模式化微孔中，24小时后，hAMSC逐渐聚集在胰岛周围并形成均匀的hAMSC层，表明成功生成hAMSC-胰岛类器官。在hAMSC-胰岛类器官中未观察到明显的细胞凋亡，胰岛和hAMSC-胰岛类器官之间的细胞活力没有显著差异。通过GSIS测定评估胰岛和hAMSC-胰岛类器官中β细胞的功能，与胰岛相比，hAMSC-胰岛类器官在低葡萄糖（5.5mM）和高葡萄糖（25mM）下分泌的胰岛素明显更多。这些结果表明hAMSC-胰岛类器官不影响β细胞的存活并增强β细胞的功能。
3.hAMSC-胰岛类器官肾包膜移植可改善免疫功能正常的T1DM小鼠的血糖控制为了评估用hAMSCs保护胰岛是否可以增强植入并更好地控制血糖，对糖尿病C57BL/6J小鼠进行了肾包膜移植。为了追踪体内的hAMSCs，移植了GFP-Luc-hAMSC-胰岛类器官的小鼠在类器官移植后1、5、10、14和21天进行麻醉，结果显示，在移植后的前14天内，肾脏部位可以清楚地观察到大量hAMSCs，但逐渐减少，在第21天，只能检测到少量GFP阳性hAMSCs。值得注意的是，与接受胰岛移植的小鼠相比，移植了hAMSC-胰岛类器官的小鼠表现出更好的血糖控制。移植后3天，hAMSC-胰岛类器官接受者的平均非空腹血糖水平明显低于胰岛接受者，30天后取回移植肾脏导致两组均出现高血糖，表明移植物控制血糖。为了评估血糖代谢情况，在移植胰岛或类器官后1周和4周进行IPGTT，IPGTT测量结果显示，所有移植类器官的小鼠在注射后2小时代谢葡萄糖，与对照组的健康小鼠相似，相比之下，所有移植胰岛的小鼠均表现出葡萄糖耐受性异常。在葡萄糖耐受性测试的所有时间点，所有类器官移植小鼠的葡萄糖清除率均显著高于胰岛移植小鼠。为了评估hAMSC是否可以保护移植物的功能和活力，对3天和30天时取出的移植肾脏进行组织学处理，胰岛素染色免疫荧光证实，移植30天后，hAMSC-胰岛类器官组的胰岛素+区域明显大于胰岛组，TUNEL测定表明，移植后3天和30天，类器官组移植物中的细胞凋亡显著减少。结果表明，在体内用hAMSC保护胰岛能够提供细胞保护，加速β细胞功能并改善血糖控制。
4.hAMSCs在体内为胰岛提供了局部移植免疫特权微环境为了评估hAMSC对移植排斥反应的影响，测量了周围免疫器官和肾脏的肿胀，对照组、胰岛组和类器官组的肾回收量差异无统计学意义，与胰岛组相比，hAMSC-胰岛类器官组的脾脏、胸腺和淋巴肿胀程度明显减轻，与对照组相似。为了确定AMSC是否为胰岛提供了移植免疫优越的微环境，在移植后3天和14天对移植物进行了CD8、CD4和F4/80免疫组化染色。值得注意的是，与胰岛组相比，类器官组移植3天和14天的CD8+和CD4+细胞浸润明显减少。此外，免疫染色显示，与胰岛组相比，类器官组第3天和第14天移植物中F4-80的表达明显降低。这些结果提示hAMSC通过重塑局部移植物免疫特权微环境来保护胰岛免受免疫排斥。
5.用hAMSC保护胰岛可抑制炎症介导的β细胞凋亡和功能障碍为进一步评价hAMSCs对胰岛的免疫保护作用，将胰岛及类器官在培养基中培养，以模拟移植瘤体内的免疫状态。活死细胞染色显示，与未暴露的胰岛相比，暴露于细胞因子的胰岛中活细胞比例、胰岛素和C肽蛋白表达显著降低。然而，与暴露于细胞因子的胰岛相比，暴露于细胞因子的类器官中胰岛素和C肽的表达显著上调。这些结果表明，用hAMSC保护胰岛可抑制炎症介导的β细胞凋亡和功能障碍。
6.hAMSC-胰岛类器官移植促进移植物血管重建为探究hAMSC-胰岛类器官组移植肾功能改善的机制，对移植肾进行血管周围细胞标志物的免疫染色分析，类器官组在14天和30天的切片中CD34、CD31和α-SMA染色阳性率明显高于胰岛组。这些数据表明，hAMSC-胰岛类器官在植入中期（第14天）和晚期（第30天）促进了丰富的血管覆盖的生成。
7.用hAMSC进行保护可防止胰岛因缺氧引起的细胞凋亡并改善其功能移植后缺氧导致早期移植物中胰岛的瞬间大量损失，这是移植后面临的一大挑战。为了评估移植后的胰岛活力和功能缺氧后，将hAMSC-胰岛类器官和胰岛在缺氧条件下培养16h，模拟体内缺血状态。活死染色及相应的定量分析显示，胰岛组在常氧和缺氧条件下的活细胞百分比分别为91.50±4.99%和66.55±10.10%，而hAMSC-胰岛类器官组在常氧和缺氧条件下的活细胞百分比分别为95.02±3.92%和98.15±1.09%。进一步证实用hAMSCs屏蔽增强了β细胞的胰岛素分泌功能。缺氧培养24小时和48小时后，胰岛的形态遭到严重破坏，而hAMSC-胰岛类器官的碎片化程度明显降低。这些结果表明，用hAMSCs保护胰岛可保护胰岛细胞免受缺氧引起的细胞凋亡和功能障碍。
8.使用hAMSCs进行屏蔽可增加β细胞的胰岛素合成、折叠和分泌为了探究hAMSC-胰岛类器官与胰岛相比胰岛素分泌明显增加的机制，将胰岛和hAMSC-胰岛类器官在低糖和高糖条件下孵育1h。qPCR分析表明，与低葡萄糖（L-GLU）和高葡萄糖（H-GLU）条件下的胰岛相比，hAMSC-胰岛类器官中的胰岛素2、GCK、CREB和IRS2mRNA显著上调，免疫荧光显示与这些结果一致。这些结果表明，hAMSCs屏蔽导致β细胞中PKA-CREB-IRS2-PI3K和PKA-PDX1信号通路激活，SIL1mRNA水平上调，Mt1mRNA水平下调，最终促进胰岛素的合成、折叠和分泌。
主要结论：
将hAMSCs与胰岛混合物在三维琼脂糖微孔板上培养，形成hAMSC-胰岛类器官结构，通过流式细胞术、全身荧光成像、免疫荧光、Calcein-AM/PI染色、ELISA、qPCR等方法探讨hAMSCs提高胰岛移植效率的潜力及机制。
本文引用：
Zhou JX, Jie-Zhou, Jin WR, et al. Human amniotic mesenchymal stem cell-islet organoids enhance the efficiency of islet engraftment in a mouse diabetes model. Life Sci. 2024;351:122812. doi:10.1016/j.lfs.2024.122812
