NK细胞分离扩增试剂盒使用说明书

货号:JFKR-NKC-500-KIT

产品介绍

NK细胞分离扩增试剂盒是一款专为NK细胞培养而设计的无血清、 无异源动物源成分的纯因子体外诱导扩增培养试剂盒，包括 NK 基础培养基、 NK-A、NK-B和NK-C。本产品适用于从人外周血单个核细胞（PBMC）\脐带血单个核细胞中选择性扩增 NK 细胞。本试剂盒包含了全流程试剂，同时培养基能够满足与类器官共培养。按照GMP标准生产。

试剂盒产品信息

试剂到货处理：

1. NK基础培养基在4 ℃可保存3个月，收到货后4 ℃保存，建议1个月内使用完毕，长期不用建议放于-20 ℃储存，避免反复冻融超过2次。

2 NK-A、NK-B、NK-C内含有维持细胞活性营养成分，为了保持试剂营养成分的活性，长期不用建议放于-20 ℃储存，避免反复冻融超过2次。

操作步骤与方法：

1 PBMC分离

1.1取新鲜静脉血与PBS缓冲液1：1 稀释，轻轻混匀待用。

1.2取15ml 离心管，添加4ml PBMC淋巴分离液，缓慢加入静脉血混合物8ml，静置待用。

1.3 2000rpm 离心20min，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合。

1.4 此时观察到15ml离心管为4层，轻轻吸取第2层白色悬浮物于15ml 离心管，混匀待用。

2 热灭活自体血浆制备

用移液器吸取上层淡黄色血浆于一个新的 50 mL 离心管，将标识好的离心管用封口膜封口，放入56~65°C水浴锅中，热灭活30~40min。1000rpm，离心10min，获得热灭活自体血浆，-20℃保存。

3 NK细胞的激活和扩增培养（以PBMC例）

3.1预处理：室温下融化组分NK-A，取 15 mL 离心管，加入3 mL PBS，吸取100ul组分NK-A至PBS中（若NK-A一次性用完，可吸取50 mL离心管内15mLDPBS 将NK-A管冲洗1次并加回离心管内），下颠倒混匀，加入T75培养瓶中，前后左右晃动，使液体分散在瓶底，37℃ 处理2小时。若不立刻使用，可置于4℃冰箱处理过夜。

3.2第0天，取出预处理的培养瓶，弃掉包被处理液，使用5 mL NK基础培养基（添加 10%的热灭活自体血浆，若无自体血浆可添加1.5%NK细胞扩增增强剂JFKR-XT-100）重悬PBMC接种于T75瓶中（推荐接种密度2×10⁶cells/mL），添加125ul组分NK-B，前后左右晃动，放入37℃，5%CO₂ 培养箱中培养。

3.3第3天，沿培养瓶侧壁缓慢补加5 mL的新鲜NK基础培养基，添加125ul组分 NK-B（添加10%的热灭活自体血浆，若无自体血浆可增加1.5%NK细胞扩增增强剂JFKR-XT-100），注意不要碰到培养瓶底部，切勿吹打细胞，尽量减少计数、观察等操作，避免影响细胞初期生长。

3.4 第5天，取样计数。NK基础培养基与组分NK-C以1000:1的比例进行配制 (即40 mL培养基中加入40ul组分NK-C)，添加5%的热灭活自体血浆，若无自体血浆可增加1.5%NK细胞扩增增强剂JFKR-XT-100 ，调整细胞密度为1.0-1.5×10⁶ cells/mL，根据细胞悬液体积进行扩瓶（小于200 mL）或转入细胞培养袋（大于200 mL）培养。

3.5 第7天后，每隔一天或两天取样计数补液，调整细胞密度为0.5-1.0×10⁶ cells/mL， 根据细胞悬液体积进行扩瓶（小于200 mL）或转入细胞培养袋（大于200 mL）培养。从第7天开始，可将补加新鲜配置好的NK基础培养基（已添加组分NK-C）中的热灭活自体血浆含量降至1%（若无自体血浆可增加1.5%NK细胞扩增增强剂JFKR-XT-100）。

3.6 培养至第 12-18 天收获细胞。

运用范围:

For Laboratory Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.